过渡态理论[1]过渡态理论，也称活化复合体理论或绝对反应速率理论，是对化学反应和其他过程的研究，认为它们是通过组成原子和分子的相对位置和势能的连续变化来进行的。在原子或分子的初始排列和最终排列之间的反应路径上，存在一种中间态，处于这个中间态时，势能达到最大值。这个最大值对应的构型被称为活化络合物，它的状态被称为过渡状态。过渡态能量与初始态能量的差值与反应的实验活化能密切相关；它表示反应或流动系统为进行转换必须获得的最小能量。在过渡态理论中，活化络合物被认为是在与处于初始状态的原子或分子的平衡状态下形成的，因此可以确定其统计和热力学性质。达到终态的速率由形成的激活复合物的数量和它们进入终态的频率决定。对于简单的系统，这些量可以用统计力学原理计算出来。用这种方法，化学或物理过程的速率常数可以用原子和分子的尺寸、原子质量和原子间或分子间的力来表示。过渡状态理论也可以用热力学术语来表述。图1：势能曲线活化能是指在化学反应中将反应物转化为产物所需的最小能量。活化能的值等于处于中间构型（称为过渡态或活化络合物）的粒子与处于初始态的反应物粒子之间的位能差。因此，活化能可以看作是反应物在生成生成物之前必须克服的障碍。反应热[2]反应热，也叫反应焓，在化学反应过程中，为了使所有物质在相同的温度下存在，必须增加或除去的热量。如果反应系统容器中的压力保持恒定值，则测量的反应热也表示随反应过程而发生的热力学量的变化，称为焓或热含量。即反应结束时物质的焓与反应开始时物质的焓之差。因此，在恒压下确定的反应热也被指定为反应焓，用符号ΔH表示。若反应热为正，则称该反应为吸热反应；如果是负的，则是放热的。伴随化学变化的热效应的预测和测量对于理解和运用化学反应是很重要的。如果包含反应系统的容器隔热程度非常高，没有热量流入或流出系统（绝热状态），则伴随转化的热效应可能表现为温度的升高或降低（视具体情况而定）。确切的反应热值对于正确设计化学过程中使用的设备是必要的。因为对每一个反应进行热测量是不现实的，而且对某些反应这样的测量甚至可能是不可行的，所以习惯上是从已编制的标准热数据的适当组合来估计反应的热。这些数据通常采用标准生成热和燃烧热的形式。标准生成热的定义是：当1摩尔化合物由其组成元素形成时，每种物质在其正常物理状态（气体、液体或固体），在25°C（77°F）和1大气压下吸收或演化的热量。元素的生成热可以随意地赋值为零。标准燃烧热的定义与此类似，即1摩尔物质在过量的氧气中燃烧时，在25°C和一大气压下所产生的热量。从测量的生成热和燃烧热计算反应热的方法是基于热总和的原理称为赫斯定律。图2：催化和热反应（非催化）反应的能量分布催化剂[3]催化剂是在化学中经常使用到的一种物质，能在不消耗自身的情况下加快反应进度。酶是自然发生的催化剂，负责许多基本的生化反应的进程加速。大多数固体催化剂是金属或金属元素以及半金属元素硼、铝和硅的氧化物、硫化物和卤化物。气态和液态催化剂通常以其纯物质形式或与适当的载体或溶剂结合使用；固体催化剂通常分散在其他被称为催化剂载体的物质中。一般来说，催化作用是催化剂和反应物之间的化学反应，形成化学中间体，这些中间体能够更容易地相互反应或与另一种反应物反应，以形成所需的最终产物。在化学中间体和反应物之间的反应中，催化剂被再生。催化剂和反应物之间的反应模式变化很大，在固体催化剂中往往是复杂的。典型的这些反应有酸碱反应、氧化还原反应、配位络合物的形成和自由基的形成。对于固体催化剂，反应机理受到表面性质和电子或晶体结构的强烈影响。某些固体催化剂，称为多功能型催化剂，能够与反应物发生多种形式的相互作用；双功能催化剂则被广泛应用于石油工业的重整反应。催化反应是许多工业化学过程的基础，且催化剂制造本身就是一个快速发展的工业过程。催化过程及其催化剂催化过程对应所使用的催化剂氨的合成铁硫酸的生产氮(II)氧化物、铂石油裂解沸石不饱和烃的加氢反应镍、铂或钯汽车尾气中碳氢化合物的氧化氧化铜、氧化钒、铂、钯正丁烷向异丁烷的异构化氯化铝、氯化氢图3：乙烯聚合工业中用到的齐格勒-纳塔催化剂乙烯气体在压力下被泵入反应容器，在该反应容器中，它在齐格勒-纳塔催化剂的影响下，在溶剂存在下进行聚合。一种由聚乙烯、未反应的乙烯单体、催化剂和溶剂组成的浆液从反应器中流出。未反应的乙烯被分离并返回反应器，而催化剂被酒精洗涤中和并过滤。多余的溶剂从热水浴中回收并回收，干燥器将湿聚乙烯脱水为其最终的粉末形式。化学中间体[4]化学中间体，指在某些反应物转化为产物过程中产生的任意化学物质。大多数合成过程都涉及通过一系列步骤将一些现成的、通常价格较为低廉的物质转化为所需的产品。一个步骤产生并用于后续步骤的所有物质都被认为是中间体。除了在中间不稳定分子生成时停止反应的物质可以作为产物回收的物质外，有些化学物质即使还没有被分离出来，也已知或假设为中间体。在一般不稳定的中间体的类别中，被研究最为充分的是自由基、碳烯和碳离子。这些中间体属于是分子的高度活性碎片，通常只在很短的时间内保持不结合。参考文献1.Laidler,KeithJ.."transition-statetheory".EncyclopediaBritannica,23Sep.2019, https://www.britannica.com/science/transition-state-theory.2.Britannica,TheEditorsofEncyclopaedia."heatofreaction".EncyclopediaBritannica,25Aug.2022, https://www.britannica.com/science/heat-of-reaction.3.Britannica,TheEditorsofEncyclopaedia."catalyst".EncyclopediaBritannica,30Oct.2022, https://www.britannica.com/science/catalyst.​​​​​​​4.Britannica,TheEditorsofEncyclopaedia."chemicalintermediate".EncyclopediaBritannica,20Jul.1998, https://www.britannica.com/science/chemical-intermediate.

一、蛋白提取蛋白分析的第一步是蛋白提取，蛋白提取方法包括化学抽提法、物理抽提法和生物学抽提法。蛋白提取无论通过机械处理还是基于去垢剂的提取方法，都会不可避免地破坏细胞稳态，导致蛋白降解或不稳定。因此，提取过程中蛋白的完整性直接决定了下游蛋白样品分析所得数据的质量。样品类型关于内源性蛋白和表达系统蛋白的研究来源主要包括哺乳动物细胞，哺乳动物组织和原代细胞。当提取哺乳动物组织中的蛋白质时，需要一些温和的酶或机械破碎手段来帮助从较复杂组织基质中分离细胞。对于仅通过质膜将细胞内容物与环境隔离开的培养哺乳动物细胞和原代细胞来说，试剂中的去垢剂可打破蛋白-脂质膜双层结构，使总蛋白提取更为容易。通常所研究的或用于重组蛋白表达系统的其他生物体包括细菌、酵母和植物。这些细胞类型含有细胞壁，需要额外使用酶解或机械破碎的方法才能有效释放蛋白。然而，目前已开发出基于去垢剂的解决方案，可有效提取和溶解这些细胞中的蛋白，而无需机械外力破坏。该方法对于处理更多样品数量或使用自动提取和纯化方案来说尤其重要。亚细胞分级分离对于大多数研究来说，只需直接制备全细胞裂解物以获取可溶蛋白样品，用于下游直接检测或进一步纯化与分离。但是，如果在蛋白提取之前将细胞分为不同的区室或细胞器，可以显著提高特定蛋白的产量或富集率。机械裂解通常会破坏所有细胞区室，使分离特定细胞组分变得更加困难。但是，通过谨慎优化试剂，已开发出基于逐级差异去垢剂的方法来分离核蛋白、胞质蛋白和膜蛋白组分。该方法可以将疏水性膜蛋白溶解，使其与亲水蛋白分离，并且可以分离完整细胞核、线粒体和其他细胞器，用于直接研究或分步提取蛋白。二、蛋白质降解细胞裂解时会破坏细胞膜和细胞器，导致蛋白水解活性不受调控，从而降低蛋白产量并影响蛋白功能。为了防止提取的蛋白降解并保持其活性，通常需要在细胞裂解试剂中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。 蛋白酶抑制剂通过与蛋白酶活性位点结合而起作用。由于蛋白水解机制的差异，单一化合物无法有效抑制所有蛋白酶，因此，需要使用几种不同抑制剂的混合物来确保蛋白提取物在下游分析之前不被降解。典型的抑制剂混合物包括丝氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶等小分子抑制剂，以及氨基肽酶和金属蛋白酶。尽管有些抑制剂是不可逆的，但很多抑制剂是可逆的，它们需要长时间存在于粗制样品中，直到后续进行了纯化，免除了蛋白水解活性的风险为止。同样，磷酸酶也各有不同，因此建议使用有效的磷酸酶混合物（含丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、酸性和碱性磷酸酶的抑制剂）来保持脆弱的磷酸化翻译后修饰。通过使用正确的保存方法来防止靶蛋白降解：快速操作并保持样品低温（可使用液氮冷冻样品）；抑制或灭活内源性蛋白酶和磷酸酶；添加保护或稳定化合物，例如还原剂和酶抑制剂；通过沉淀稳定或灭活蛋白。三、蛋白样品除杂蛋白提取后，蛋白样品通常含有影响蛋白稳定性或与下游应用不兼容的杂质。透析、脱盐和浓缩是去除蛋白样品中常见小分子污染物（例如盐和去垢剂）的三种常用方法。根据下游应用要求，选择方法时的考虑因素可能包括样品起始量、蛋白功能和处理时间。透析、脱盐和浓缩的有多种规格和包装形式。透析透析是一种经典分离技术，它通过半透膜选择性扩散，去除蛋白溶液中的小分子和不需要的化合物。将样品和缓冲液置于膜的相对侧。大于膜孔的蛋白保留在膜的样品侧，较小的分子（污染物）通过膜自由扩散，直至达到平衡浓度。这种技术可以使样品中小分子污染物的浓度降低至可接受水平。脱盐常用的脱盐方法有透析法、电透析法和凝胶过滤法。透析法及电透析法耗时长，样品稀释度大，不易放大进行大规模生产，所以工业生产中应用较少。凝胶过滤层析脱盐过程中盐分子和蛋白质分子大小差异巨大，蛋白质溶液中小分子的盐分子随着层析流动相进入孔径较小的固定相，使其在层析中的迁移速率小，而蛋白质因分子尺寸较大，不能随流动相进入固定相中，因此在层析柱中的迁移速率大，首先从层析术中流出，实现脱盐。浓缩蛋白浓缩与透析法类似，其使用半透膜将蛋白与小分子量化合物分离。与透析法的被动扩散原理不同，浓缩是通过离心使溶液穿过膜而实现的。在离心过程中，缓冲液和小分子量溶质均被动穿过膜，并在另一侧收集（滤液）。大分子（蛋白）保留在膜的样品侧，其随着试剂被动穿过膜到达另一侧而浓缩为小体积液体（截留液）。四、蛋白定量紫外分光光度法蛋白质分子中存在含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，使蛋白质对280nm的光波具有最大吸收值，在一定的范围内，蛋白质溶液的吸光值与其浓度成正比，可作定量测定。该法操作简单、快捷，并且测定的样品可以回收，低浓度盐类不干扰测定结果，故在蛋白质和酶的生化制备中广泛被采用。但此方法存在以下缺点：1.当待测的蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基含量差别较大会产生一定的误差，故该法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的样品。 2.若样品中含有其他在280nm吸收的物质如核酸等化合物，就会出现较大的干扰。但核酸的吸收高峰在260nm，因此分别测定280nm和260nm两处的光吸收值，通过计算可以适当的消除核酸对于测定蛋白质浓度的干扰作用。但因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不同的，虽经校正，测定结果还存在着一定的误差。荧光法蛋白定量基于荧光进行蛋白定量是除比色法以外的另一选择。荧光检测法具有出色的灵敏度，所需蛋白样品量少，可节省更多样品用于其他实验。此外，读取时间并非关键因素，因此这种检测方法可轻松应用于自动化高通量分析。可使用荧光计或酶标仪检测荧光信号。Bradford法1976年Bradford建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合的原理，是一种能够迅速并且准确的定量蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收光的改变，从465nm变为595nm。蛋白质-染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度(最低检出量为1μg)。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子如K+，Na+，Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如TritonX-100，SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。由于染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛用于蛋白质含量的测定。总氮量的测定——微量凯氏定氮法：当被测定的含氮有机物与浓硫酸共热消化时，分解出氮、二氧化碳和水，其中氮与硫酸化合成硫酸铵。由于分解反应进行得很慢，故可加入硫酸铜和硫酸钾或硫酸钠，其中硫酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点，氧化剂(过氧化氢)也能加速反应。消化终止后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸氨分解放出氨;用水蒸气蒸馏，将氨蒸入过量的标准无机酸溶液中，全部蒸完之后，用标准的盐酸溶液滴定收集的氨量，准确测定氨量，从而折算出蛋白质含量。双缩脲法具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中能与Cu2+络合呈紫红色，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法进行测定，根据标准曲线进行计算可以确定蛋白质浓度。Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的经典方法，它是在双缩脲法的基础上发展而来的。它操作简单、迅速、灵敏度高，较双缩脲法灵敏100倍。Folin-酚法所用的试剂由两部分组成，试剂A相当于双缩脲试剂。蛋白质中的肽键与试剂A中的碱性硫酸铜反应形成铜-蛋白质复合物。这个复合物可与试剂B中磷钼酸-磷钨酸发生氧化还原反应。由于磷钼酸与磷钨酸易被酚类化合物还原而呈蓝色反应。而蛋白质中的酪氨酸和色氨酸均可发生此呈色反应。颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色法测定蛋白质的含量。此法易受蛋白质样品中酚类化合物及柠檬酸的干扰。另外，试剂B中的磷钼酸-磷钨酸仅在酸性pH值时稳定，故在将试剂B加入到碱性的铜-蛋白质溶液时，必须立即混合均匀。以确保还原反应能正常发生。此法也适用与酪氨酸和色氨酸的定量测定。五、蛋白检测根据实验需要，可以使用多种方法来检测和分析靶蛋白。以下是用于检测和分析复杂混合物（例如裂解物和血清）中蛋白质的常见技术，以及各种技术的特点和常见要求。ELISA蛋白质免疫印迹质谱分析​​​​​​​优势可进行96-孔或384-孔板的高通量分析可定量靶蛋白分子量测定和蛋白鉴定可以对靶蛋白进行分离和区分在同一份样品中定性和定量多个靶标检测蛋白翻译后修饰或不同亚型灵敏度<5–10pg/mL从低飞克到高阿克摩尔范围（1018）裂解液兼容性对于非活性检测ELISA：基于离子型去垢剂的裂解液对于活性检测ELISA：基于非离子型去垢剂的裂解液（例如NP-40、TritonX-100）对于SDS-PAGE（变性）：RIPA或含其他含离子型去垢剂的裂解液对于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）：基于非离子型去垢剂的裂解液（例如NP-40、TritonX-100）质谱分析前必须去除样品中的去垢剂和高盐物质常规所需蛋白量0.1–1µg/mL1–50µg<1µg所需设备酶标仪X光胶片或CCD成像系统质谱仪

不对称相转移催化（PTC）现已作为众多均相合成机转化的"绿色"替代途径，同时也得到了广泛的应用。不对称相转移催化的典型手性有机催化剂就是合成的修饰金鸡纳生物碱。目前已经开发了几代O-烷基N-芳基甲基衍生物，可以以高对映选择性催化甘氨酸亚胺的烷基化反应，并生成一系列α-氨基酸衍生物（表1）。​​​​​​​图1.甘氨酸亚胺的烷基化反应ProductNo.N-ArO-AlkX-Cat.Gen.R-Br%Y%ee-BenzylHBr1stPhCH2-8560B120844BenzylHCl1st4-Cl-C6H4-CH2-9566O330517BenzylAllylBr2nd4-Cl-C6H4-CH2--81N3435039-AnthracenylmethylHCl3rdPhCH2-6891O3027049-AnthracenylmethylAllylBr3rdPhCH2-8794-2,7AnthracenylmethylAllylBrdimeric4-NO2-C6H4-CH29199表1.甘氨酸亚胺的烷基化反应为了进一步提高催化剂的对映选择性，Jew和Park通过间隔单元连接了两个金鸡纳生物碱分子。使用了这种二聚体金鸡纳生物碱催化后，上表所述的甘氨酸亚胺烷基化的对映选择性被提高至到97-99%ee。[1-3]亲核催化剂在新型合成方法的发展中起到了重要作用。尤其是，金鸡纳生物碱能以高对映选择性催化许多实用的合成过程。金鸡纳生物碱可以作为碱，使得带有相对酸性质子的底物进行去质子化，进而在产生的阴离子和质子化的胺之间形成紧密离子对。二者的相互作用会导致阴离子周围出现手性环境，并允许其与亲电试剂发生对映选择性反应。在诸多此类过程的进行中，如何控制具有高对映体的季碳不对称中心的生成是最重要的。使用(DHQD)2AQN催化剂，可以通过TMSCN与相应的氰醇的加成，以优异的产率和对映体过量来影响酮类的α-官能化（方案1）。[4]方案1无金属的烯丙基胺化反应为传统的钯催化π-烯丙基方法提供了一个实用的扩展。使用(DHQ)2PYR可以在远程的γ位与二酰亚胺进行胺化反应(方案2)，进而形成各种高度官能化的氨基化合物。[5]方案2最后，Jørgensen和他的同事开发了第一个使用(DHQ)2PHAL催化的对映选择性炔酮共轭加成反应。[6] 对于脂肪族炔酮和芳香族化合物来说，β-二酮的加成促使(E)-和(Z)-烯酮的混合物以高产率和对映选择性生成（方案3）。​​​​​​​方案3参考文献1.O'Donnell MJ. 2004. TheEnantioselectiveSynthesisofAminoAcidsbyPhase-TransferCatalysiswithAchiralSchiffBaseEsters. Acc.Chem.Res.. 37(8):506-517. https://doi.org/10.1021/ar03006252.Lygo B, Andrews BI. 2004. AsymmetricPhase-TransferCatalysisUtilizingChiralQuaternaryAmmoniumSalts: AsymmetricAlkylationofGlycineImines. Acc.Chem.Res.. 37(8):518-525. https://doi.org/10.1021/ar030058t3.Jew S, Jeong B, Yoo M, Huh H, Park H. 2001. SynthesisandapplicationofdimericCinchonaalkaloidphase-transfercatalysts:bis[O(9)-allylcinchonidinium]-o,m,orp-xylenedibromide. Chem.Commun..(14):1244-1245. https://doi.org/10.1039/b102584h4.Tian S, Hong R, Deng L. 2003. CatalyticAsymmetricCyanosilylationofKetoneswithChiralLewisBase. J.Am.Chem.Soc.. 125(33):9900-9901. https://doi.org/10.1021/ja036222p5.Poulsen TB, Alemparte C, Jørgensen KA. 2005. EnantioselectiveOrganocatalyticAllylicAmination. J.Am.Chem.Soc.. 127(33):11614-11615. https://doi.org/10.1021/ja05398476.Bella M, Jørgensen KA. 2004. OrganocatalyticEnantioselectiveConjugateAdditiontoAlkynones. J.Am.Chem.Soc.. 126(18):5672-5673. https://doi.org/10.1021/ja0493594