在生物分析化学中，使用分离细胞器以分析其含量或功能是非常重要的，它是许多生物医学分析的基础。一般情况下，使用机械均质法制备细胞均质液后，会有多种细胞器类型的混合物。然后，利用免疫亲和分离或离心对细胞器进行分馏，通过分馏我们可以获得富集的目标细胞器组分。在此过程中，要求具备细胞器的污染水平较低，相关分析技术灵敏度高，且具备低样品量兼容特性，以及获得特定细胞器类型亚组分的能力。科学家们开发了许多更好的富集技术来满足生物分析化学中的这些需求。在这里，我们重点介绍磁颗粒对细胞器的免疫亲和分离的应用。图1：细胞内部各细胞器示意图细胞器的免疫亲和分离是基于抗体与目标细胞器表面发现的抗原或蛋白质之间的相互作用进行的。然而，随着合适抗体数量的不断增加，以及对免疫纯化细胞器功能状态的评估能力的提高，这一格局开始发生变化。关于利用抗体偶联磁颗粒分离细胞器的报道很多，包括突触囊泡、外泌体、叶绿体、线粒体、过氧化物酶体和溶酶体的分离。突触囊泡突触囊泡可能是最丰富的囊泡细胞器，由于纯化程度高，其功能和分子组成已经得到了很好的研究。它们在电子显微镜水平上呈球形，特征横截面直径约为40nm±4%~9%。突触囊泡可以通过差速离心、基于密度的沉淀和大小分级分离纯化，而如今它们也可以通过结合各种识别突触囊泡蛋白的抗体的磁性颗粒来纯化。Burré等人通过低渗休克从大鼠脑中释放突触囊泡，然后使用蔗糖密度梯度离心纯化。他们还通过使用四种不同类型的磁颗粒进行免疫分离纯化了特定的梯度组分。结果表明，M-280羊抗鼠珠是效率最高的一组，为后续实验提供了低非特异性结合的纯突触囊泡样品。液外泌体是细胞外囊泡的一个亚群，直径约为30至100nm。它们由脂质、碳水化合物、蛋白质和核酸组成，可以作为细胞间通讯的一种方式，从起源细胞释放出来，在靶细胞上启动不同的功能。利用靶向外泌体特异性标记物，可以以越来越高的纯度捕获特异性外泌体。该策略对于从培养基补充物中去除共富集的外泌体和分离外泌体亚群也是理想的。考虑到与后续分析的兼容性，基于珠状体的方法是一种用于特异性捕获的通用方法。虽然乳胶珠已被用于特异性捕获，但该方案涉及许多离心步骤，并且在可重复性方面具有挑战性。因此，磁性颗粒的磁分离是一种更好的方法，可以替代乳胶珠进行外泌体捕获，它可以在大小、形态和蛋白质含量方面分离出更均匀的囊泡群。Clayton等人开发了一种快速、通用的外泌体分离技术。该方法使用抗mhcII类抗体包被到更大的固体表面（4.5μm磁性颗粒）进行下游分析。叶绿体不同细胞类型的叶绿体结构是不同的。然而，通常很难从特定细胞中分离出叶绿体，因此我们对不同叶绿体结构和功能之间的关系了解不多。Truernit等人开发了一种方法，利用外源黄色荧光蛋白标记来自单个细胞类型的叶绿体表面，然后通过免疫原性方法分离出这些叶绿体。将整个叶片匀浆后，标记的和未标记的叶绿体都被释放出来，标记的叶绿体可以通过包裹有绿色荧光蛋白抗体的磁性颗粒进行分离。他们发现，各种叶绿体转录物的丰度在拟南芥海绵状叶肉细胞、维管细胞和表皮细胞之间存在差异。而且，这种方法基于遗传逻辑，因此也可用于从其他可转化生物中分离细胞器或亚细胞区室。线粒体线粒体通过调节细胞的关键功能，在维持细胞的生命和死亡过程中发挥重要作用。因此，线粒体功能障碍可导致多种人类疾病，并可能与癌症、心血管疾病、神经退行性疾病等有关。开发技术来获取线粒体靶点，以治疗线粒体功能障碍相关疾病，是人们越来越感兴趣和紧迫的问题。Banik等人报道了一种靶向线粒体的磁性纳米粒子（Mito-magneto），它可以在不需要离心和免疫沉淀的情况下有效地分离线粒体（图1）。Mito-magneto是一种基于Fe3O4磁铁矿的磁性纳米粒子，其表面被三苯磷（TPP）阳离子功能化。这种磁性纳米颗粒能够在磁场的影响下分离线粒体，并且获得的线粒体完整、纯净且具有呼吸活性。此外，它还消除了通常与使用离心分离负载纳米颗粒的线粒体相关的伪影。图2：采用磁性颗粒和试剂为基础的线粒体分离程序示意图过氧化物酶体产生活性氧的过氧化物酶体可能参与先天生物分子和异种生物的生物转化。为了避免与其他共分离细胞器中发生的生物转化混淆，分离出污染物较少的功能性过氧化物酶体来研究这些细胞器中发生的生物转化是很重要的。Wang等人将针对70kDa过氧化物酶体膜蛋白的抗体固定在包裹有蛋白a的硅化磁性氧化铁颗粒上，然后，他们从L6大鼠成肌细胞匀浆中磁性捕获过氧化物酶体，随后进行洗涤并通过酶测定分析亚细胞组成。结果表明，过氧化物酶体纯度更高，并保留了其生物活性。溶酶体溶酶体是具有消化酶的膜结合细胞器。它们参与各种细胞过程，包括分解多余或破损的细胞部分，摧毁入侵的病毒和细菌，以及细胞凋亡。溶酶体表面有V-ATPase的表达。基于此，Nylandsted等人在免疫纯化程序中利用抗v-atpase抗体富集溶酶体。磁柱内保留的细胞器本质上是酸性的。蛋白质组学分析结果显示，富集蛋白的亚细胞定位主要来自溶酶体和部分核内体。此外，只发现了一种线粒体相关蛋白，没有检测到任何高尔基体、质膜和内质网积分膜蛋白，这表明该方法足以纯化溶酶体。参考文献1.Šafařík,I.,&Šafaříková,M.(2002).Magneticnanoparticlesandbiosciences.Innanostructuredmaterials (pp.1-23).Springer,Vienna. https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-7091-6740-3_12.Burré,J.,Zimmermann,H.,&Volknandt,W.(2007).Immunoisolationandsubfractionationofsynapticvesicleproteins.Analyticalbiochemistry,362(2),172-181. https://doi.org/10.1016/j.ab.2006.12.0453.Truernit,E.,&Hibberd,J.M.(2007).Immunogenictaggingofchloroplastsallowstheirisolationfromdefinedcelltypes.ThePlantJournal,50(5),926-932. https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2007.03113.x4.Wang,Y.,Taylor,T.H.,&Arriaga,E.A.(2012).Analysisofthebioactivityofmagneticallyimmunoisolatedperoxisomes.Analyticalandbioanalyticalchemistry,402(1),41-49. https://link.springer.com/article/10.1007/s00216-011-5476-35.Satori,C.P.,Kostal,V.,&Arriaga,E.A.(2012).Reviewrecentadvancesintheanalysisofisolatedorganelles.Analyticachimicaacta,753,8-18. https://doi.org/10.1016/j.aca.2012.09.0416.Banik,B.,&Dhar,S.(2018).Centrifugation‐FreeMagneticIsolationofFunctionalMitochondriaUsingParamagneticIronOxideNanoparticles.Currentprotocolsincellbiology,76(1),25-4. https://doi.org/10.1002/cpcb.267.Oksvold,M.P.,Neurauter,A.,&Pedersen,K.W.(2015).Magneticbead-basedisolationofexosomes.InRNAInterference(pp.465-481).HumanaPress,NewYork,NY. https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-4939-1538-5_278.Tchikov,V.,Fritsch,J.,Kabelitz,D.,&Schütze,S.(2010).Immunomagneticisolationofsubcellularcompartments.InMethodsinMicrobiology(Vol.37,pp.21-33).AcademicPress. https://doi.org/10.1016/S0580-9517(10)37002-4

自1971年脯氨酸催化不对称合成首次被报道以来[1]，很多利用脯氨酸及其衍生物的不对称合成都被开发出来。脯氨酸类有机催化剂主要用于各类不对称aldol反应和不对称1,4-加成，也可进一步用于天然产物的合成。阿拉丁提供多种能够产生复杂中间体的高性能脯氨酸衍生有机催化剂，满足您的研发需求。脯氨醇衍生物[I135692]的应用[2]研究人员已经开发出一种新的有机催化串联反应，其中α,β-不饱和醛和纳扎罗夫试剂由二芳基酚醚催化，遵循Michael/Morita-Baylis-Hillman机理。对于多种α,β-不饱和醛和不同的β-酮酯，反应都可以以很高的对映体和非对映体选择性进行。机理研究表明，TMS保护的脯氨醇还可作为Morita-Baylis-Hillman反应的催化剂，是该反应中报道的第一个手性仲胺催化剂。此外，已经提出了许多立体选择性转化，可产生具有多达四个立体中心的各种类型的光学活性环己烯酮和环己酮衍生物。[R468479]的应用[3]一锅法操作可以在一个锅中进行多次转化和形成多个键，同时减少了多个纯化步骤，最大限度地减少了化学废物的产生，节省了时间。为了简化合成，研究人员通过少量一锅法操作研究了达菲（Tamiflu）的制备。他们的策略是在一锅操作中构建一个关键的、完全功能化的环己烯羧酸乙酯中间体作为第一步；在此之后，剩余的合成仅由官能团操作组成，也在一锅操作中进行。第一个关键反应依赖于有机小分子催化试剂，这是一种相对较新的、快速发展的合成有机化学技术。脯氨酸衍生物[P108709]的应用[4]由于缺乏快速构建和耦合差异化保护单糖的化学策略，对碳水化合物的研究受到了阻碍。这里，提出了一种基于三种醛的醛醇缩合反应的合成路线，用于在仅两个化学步骤中从头生成多元醇分化的己糖。在由L-脯氨酸催化的α-氧基醛的二聚反应后，紧接着是由路易斯酸催化的Mukaiyama醛醇加成-环化串联步骤。仅需更改所用的溶剂和路易斯酸，就可以以高产量和立体化学纯度分别选择受到差异保护的葡萄糖、阿洛糖和甘露糖立体异构体。该反应顺序还能有效产生13C标记的类似物以及结构变体，如2-氨基和2-硫代取代衍生物。[S161308]的应用[5]研究人员成功地报道了在水介质中使用环状和非环状酮和各种醛进行不对称直接羟醛反应的高效有机催化剂。在大多数情况下，通过在盐水中使用0.5mol%的催化剂，已经可以实现>99%的ee。该催化剂的另一个优点是，它不需要任何酸添加剂来实现高对映体选择性。参考文献1.U.Eder,G.Sauer,R.Wiechert,Angew.Chem.Int.Ed.1971,10,496.DOI:https://doi.org/10.1002/anie.1971049612.S.Cabrera,J.Alemán,P.Bolze,S.Bertelsen,K.A.Jørgensen,Angew.Chem.Int.Ed.2008,47,121.DOI:https://doi.org/10.1002/anie.2007040763.H.Ishikawa,T.Suzuki,Y.Hayashi,Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,1304.DOI:https://doi.org/10.1002/anie.2008048834.A.B.Northrup,D.W.C.MacMillan,Science2004,305,1752.DOI:https://doi.org/10.1126/science.11017105.V.Maya,M.Raj,V.K.Singh,Org.Lett.2007,9,2593.DOI:https://doi.org/10.1021/ol071013l

免疫沉淀（IP）是应用最广泛的免疫化学技术之一。免疫沉淀，然后是SDS-PAGE和免疫印迹，通常用于各种应用，例如：确定蛋白质抗原的分子量，研究蛋白质间相互作用，确定特异性酶活性，监测蛋白质翻译后修饰，并确定蛋白质的存在和数量。在IP方法中，来自细胞或组织匀浆的蛋白质通过免疫复合物在适当的裂解缓冲液中沉淀，所述免疫复合物包括抗原（蛋白质）、第一抗体和蛋白质A-、G-或L-蔗糖缀合物或第二抗体琼脂糖缀合物。琼脂糖缀合物的选择取决于初级抗体的物种来源和同种型。所描述的方法是可比较的，并且方法的选择取决于特异性抗原抗体系统。试剂和设备1.琼脂糖缀合物：固定在Sepharose®CL-4B（产品编号P405880）或G蛋白琼脂糖4B（产品编号R394624）或L蛋白琼脂糖（产品编号P394623）上的A蛋白，或抗体-琼脂糖缀合体（根据第一抗体的物种来源和同种型的第二抗体缀合物）2.细胞或组织裂解物制备3.免疫沉淀一级抗体和非相关抗体（阴性对照）4.SDS-PAGE和免疫印迹试剂及设备5.HNTG缓冲液：20mMHEPES缓冲液，pH7.5（产品编号H109406），含有150mMNaCl（产品编号S301560）、0.1%（w/v）TritonX-100（产品编号T434565）和10%（w/v）甘油（产品编号G424796）6.洗涤缓冲液（冰冷）：HNTG缓冲液，或PBSpH7.4（产品编号R355028），或根据所需洗涤严格程度的其他缓冲液（RIPA缓冲液 产品编号R488105）7.具有或不具有2-巯基乙醇（2-ME（产品编号M301574））的莱姆利样品缓冲液（例如1x、2x或3x）8.微型离心管9.微型离心机和振动筛免疫步骤特异性抗原的免疫沉淀注意：除非另有说明，否则在冰上使用微型离心管执行所有IP步骤。用洗涤缓冲液洗涤琼脂糖缀合物两次，在室温下以12000xg离心10秒，丢弃上清液。注意：如果琼脂糖缀合物是粉末，则用去离子H2O将其重建，并使其膨胀5分钟。在洗涤缓冲液（50%悬浮液）中重新悬浮琼脂糖缀合物。根据需要，继续使用方法A或方法B。方法A1.在微量离心管中将琼脂糖缀合物分成50-100µL（约25-50µL琼脂糖/床体积）的等分试样。2.在每根试管中加入10µL适当稀释的初级抗体。3.在室温下培养15-60分钟，在合适的摇壶上轻轻混合样品。4.在4°C下以3000xg离心2分钟，丢弃上清液。5.用1mL洗涤缓冲液洗涤每个样品，在4°C下以3000xg离心2分钟，重复此步骤至少两次。6.向每根试管中加入0.1-1.0mL的细胞裂解物。7.在4°C下培养90分钟至过夜，在合适的摇壶上轻轻混合样品。8.通过在4°C下以3000xg离心2分钟来收集免疫沉淀的复合物，丢弃上清液。9.用1mL洗涤缓冲液洗涤颗粒，在4°C下以3000xg离心2分钟。重复此步骤至少3次。方法B1.向细胞裂解物样品（0.1-1.0mL）中加入10µL适当稀释的抗体（参考产品规范）。2.在4°C下培养90分钟至过夜，在合适的摇壶上轻轻混合样品。3.加入50-100µL琼脂糖缀合物悬浮液（约25-50µL琼脂糖/床体积）。4.在4°C下培养15-60分钟，用摇壶轻轻混合样品。5.通过在4°C下以3000xg离心2分钟来收集免疫沉淀的复合物，丢弃上清液。6.通过重悬浮和在4°C下以3000xg离心2分钟，用1ml洗涤缓冲液洗涤颗粒。重复此步骤至少3次。SDS-PAGE的制备1.将每个颗粒重新悬浮在25-100µL莱姆利样品缓冲液中，最终浓度为1x样品缓冲液，将样品在95°C下加热5分钟。2.在室温下以12000xg离心30秒。收集上清液（IP样品）。如果需要，（在蛋白质稳定性允许的情况下）IP样品可以储存在-70°C的样品缓冲液中。3.在SDS-PAGE上运行已知浓度的样品和MW标准品（聚丙烯酰胺凝胶的适当百分比取决于蛋白质的分子大小）。4.转移到硝化纤维上，进行免疫印迹。免疫沉淀（IP）的常见问题及解答1.用于一般免染的抗体是否都可以用作免疫沉淀实验？ 答：抗体的性质对免疫沉淀实验影响很大。抗体不同，和抗原以及ProteinG或ProteinA的结合能力也就不同。所以一般免染能结合的抗体未必能用于IP反应。一般来说，多抗是沉淀反应最好的选择。另外，纯化的单抗、腹水和杂交瘤上清液也可用于免疫沉淀。2.为什么溶解抗原的缓冲液中要加入一定量的蛋白酶抑制剂？ 答：从活性细胞裂解出来的样品中，往往含有一定量的蛋白酶。为防止预检测蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，并且在低温下进行实验。3.溶解抗原的缓冲液的配制需要注意什么？ 答：多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强表面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱表面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合。4.免疫沉淀实验应如何把握抗体和缓冲液的比例？ 答：每次沉淀实验之前，考虑抗体/缓冲液的比例十分重要。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清；缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。具体比例视具体情况而定。5.免疫沉淀应该如何配制细胞裂解液？ 答：适当的细胞裂解液的选择取决于所要研究蛋白的特性。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂，作用温和；DOC(sodiumde-oxycholate)，SDS是离子性的强活性剂。所以裂解液的配制时所用去污剂的种类和浓度以及盐浓度等条件需实验者进行优化。注意如果忘记加TritonX-100，只加DOC或SDS，可能使抗体完全失去活性。参考文献[1]HarlowE,LaneD.1988.Antibodies:ALaboratoryManual. LaboratoryPressNewYork:ColdSpringHarbor.