当细胞悬浮液通过流式细胞仪时，鞘液通过流体动力学聚焦细胞，使它们以单行形式通过小喷嘴。由此产生的微笑流体流每次将一个细胞带过激光，如图1所示图1.流式细胞仪图概述了流式细胞仪。鞘液聚焦细胞悬浮液，使细胞一次通过激光束。检测向前和侧向散射光以及染色细胞发出的荧光。多色流式细胞仪图2.基本多色流式细胞术技术概述当样品被引入多色流式细胞仪流动室时，它进入流体系统并在称为流体动力学聚焦的过程中分离成单个细胞。流体动力聚焦使用受控的流体流动将样品聚焦成狭窄的直径，导致细胞分离并排列成单列。当每个细胞通过激光时，一起将其记录为一个事件。对于每个事件，随后记录前向散射和侧向散射。如果细胞被荧光标记，激光会激发萤光团，并且发射的光被收集为荧光强度。对于检测萤光团发射的特定波长的仪器，发射的光穿过一系列镜子和滤光片，直到到达适当的检测器。检测器称为光电倍增管（PMT），仅检测特定波长的荧光。滤光片阻挡某些波长并让其他波长通过。当以一定角度放置时，二项色滤光片充当镜子，允许特定波长通过，而其他波长则被反射。二项色滤光片的类型和顺序允许同时检测多个信号。前向和侧向散射光的测量所有穿过光束的细胞活颗粒都会散射激光，由光束前面的检测器测量为前向散射（FS），以及从检测器到光束侧面测量的侧向散射（SS）（图3）。图3.当绿色激光照向细胞时发生散射。细胞散射光的方向与细胞大小和力度相关。FS与细胞大小相关，SS与细胞粒度成正比。因此，细胞群通常可以根据其大小和粒度的差异来区分（图4）。图4.a）流式细胞术测量激光的前向散射（FS）和侧向散射（SS），反映细胞大小和粒度。b）典型图显示如何根据FS和SS数据区分不同的免疫细胞类型。一个有用的例子实在流式细胞仪上运行血液样本。较大且颗粒较多的粒细胞被视为具有较高SS和FS的大量细胞单核细胞是大细胞，但颗粒较小，因此它们会产生具有高FS但较低SS的单独群体。较小的淋巴细胞和淋巴母细胞形成独立的群体，FS较低，并且SS也较低，因为他们不是颗粒细胞因此，这些细胞可以仅根据其FS和SS分为不同的群体（图5）。图5.流式细胞术图：FS与SS的点图。每个点代表流式细胞仪分析的单个细胞。细胞大小和粒度的差异决定可不同细胞群的特征位置。散射光和荧光的测量除了测量样品中所有细胞或颗粒的前向和侧向散射光外，流式细胞仪内的荧光检测器还测量阳性染色的细胞或颗粒发出的荧光。例如，可以用针对特定蛋白质的荧光标记抗体或结合特定结构（例如DNA）的荧光配体对它们进行染色。当被具有相应激发波长的激光激发时，这些萤光团（或荧光染料）会发光。来自染色细胞的FS和SS光和荧光被分成规定的波长，并通过流式细胞仪内的一组滤光片和镜子引导至称为光电倍增管（PMT）的传感器。PMT将光子的能量转换为电信号（电压）。荧光经过过滤，以便每个传感器仅检测特定波长的荧光。在图6所示的示例中，异硫氰酸荧光素（FITC）通道PMT将检测FITC发出的波长约为519nm的光。藻红蛋白（PE）通道PMT将检测PE发出的575nm波长的光。每个PMT还将检测样品中存在的任何其他物质，其发射的光的波长与其所检测的荧光团相似。图6. 用荧光抗体染色的细胞经过激光。流式细胞仪中使用各种滤光片将正确波长的光子引导至每个PMT（图7）.短通（SP）滤光片允许传输低于指定波长的光子，而长通（LP）滤光片允许传输高于指定波长的光子。二向色滤光片/反射镜（例如二向色LP反射镜）与光束成45°角防止，并重定向而不是完全阻挡不需要的波长的光。例如，高于特定波长的光子在长通二向色滤光片中直接向前传输，而低于特定波长的光子以90°角反射。图7.流式细胞仪中的带通（BP）、短通（SP）和二向色滤光片。参考文献1.McKinnonKM.FlowCytometry:AnOverview. CurrProtocImmunol 2018;120:5.1.1-5.1.112.Holmberg-ThydenS,GronbaekK,GangAO,etal.Auser’sguidetomulticolorflowcytometrypanelsforcomprehensiveimmuneprofiling. AnalyticalBiochemistry 2021;627:1142103.MaciorowskiZ,ChattopadhyayPK,JainP.BasicMulticolorFlowCytometry. CurrProtocImmunol 2017;117:5.4.1-5.4.38

1,3,4-噻二唑（1,3,4-thiadiazole）是一种含硫的有机化合物，其分子结构包括一个噻二唑环和两个氮原子,是一种含有噻吩环的五元杂环化合物。1,3,4-噻二唑比其他异构体得到了更多的研究。由于硫原子的诱导作用，1,3,4-噻二唑环是一个非常弱的碱，并且具有相对较高的芳香性。它在酸性水溶液中相对稳定，但可以与碱水溶液发生环断裂。此外，由于氮原子的吸电子效应，该环也被证明是非常缺电子的，并且对亲电取代相对惰性，但易受亲核攻击，而当取代被引入该环的2'或5'位时，它将被高度活化并容易反应产生各种衍生物。因此，拥有这些1,3,4-噻二唑衍生物的性质在医药、农业、材料化学等领域有着广泛的应用。图1.1,3,4-噻二唑的医药和科技应用实例。1,3,4-噻二唑衍生物具有广泛的生物活性[1]。它们在医学、农业和材料技术方面有许多应用[2-3]。许多带有1,3,4-噻二唑部分的化合物在医学领域中对治疗各种疾病是有效的。目前，有几种基于1,3,4-噻二唑的上市药物（如图1中的化合物1和2）和候选药物处于不同的临床测试阶段[4]。磺胺甲二唑（Sulfamethizole）是一种磺酰胺类抗生素，用于治疗多种易感细菌感染。磺酰胺类是一种合成的抑菌抗生素，对大多数革兰氏阳性和许多革兰氏阴性菌具有广谱性。然而，单个物种的许多菌株可能具有抗性。磺酰胺通过在叶酸代谢周期中充当对氨基苯甲酸的竞争性抑制剂来抑制细菌的增殖。细菌对各种磺酰胺的敏感性是相同的，对一种磺酰胺的耐药性表明对所有磺酰胺都有耐药性。大多数磺酰胺很容易被口服吸收。然而，肠外给药是困难的，因为可溶性磺酰胺盐是高度碱性的并且对组织有刺激性。磺胺类药物广泛分布于所有组织中，其在胸膜、腹膜、滑膜和眼球液中的浓度较高。尽管这些药物不再用于治疗脑膜炎，但在脑膜感染中脑脊液中的浓度较高。它们的抗菌作用受到脓液的抑制。硫胺噻唑是细菌酶二氢叶酸合成酶的竞争性抑制剂。正常的对氨基苯甲酸（PABA）底物被阻止结合。在这些微生物中，这种被抑制的反应对叶酸的合成是必要的。乙酰唑胺是一种碳酸酐酶抑制剂，用于治疗心力衰竭或药物引起的水肿、某些类型的癫痫和青光眼。乙酰唑胺不是一种汞利尿剂。相反，它是一种非抗菌的磺胺类药物，其化学结构和药理活性与抗菌磺胺类明显不同。乙酰唑胺的抗惊厥活性可能取决于对中枢神经系统中碳酸酐酶的直接抑制，这种抑制会降低肺泡中的二氧化碳张力，从而增加动脉血氧张力。利尿作用取决于对碳酸酐酶的抑制，导致肾小管腔内可用于主动运输的氢离子减少。这导致尿液呈碱性，碳酸氢盐、钠、钾和水的排泄量增加。许多1,3,4-噻二唑衍生物作为除草剂、杀虫剂、杀菌剂[5]和作物保护剂[6]也已在农业领域获得专利。由于1,3,4-噻二唑核的缺电子性质、良好的电子接受能力以及热稳定性和化学稳定性，噻二唑在光学和电化学方面有着广泛的应用。此外，应用主要集中在它们的电荷传输能力、光致发光、光电导性、获得液晶的介晶性、金属的抗腐蚀活性等方面。1,3,4-噻二唑在材料领域的应用包括金属络合剂[7]、腐蚀和氧化抑制剂[8]、光学活性液晶（例如，图1中的化合物3）[9]和光电子材料[10]。参考文献1. (a)Shadiha,S.K.;Thushara,B.S.;Marathakam,A.;Midhula,C.C.;Baijika,P.Intern.J.Pharm.Pharmaceut.Res.2018,12,211-220.(b)Joseph,L.;George,M.;Mathews,P.J.Pharmaceut.Chem.Biol.Sci.2015,3,329-345.(c)Matysiak,J.Mini-Rev.Med.Chem.2015,15,762-775.2. Hu,Y.;Li,C.-Y.;Wang,X.-M.;Yang,Y.-H.;Zhu,H.-L.Chem.Rev.2014,114,5572-5610.3. Koutentis,P.A.;Constantinides,C.P.inComprehensiveHeterocyclicChemistry,3rdedition,eds.A.R.Katritzky,C.A.Ramsden,E.F.V.Scriven,andR.J.K.Taylor,Pergamon,Oxford,2008.Vol.5,p.568.4. Informationretrievedfromtheopendatabaseatwww.drugbank.ca;accessedonApril2019.5. Heil,M.;Erdelen,C.;Wachendorff-Neumann,U.;Turberg,A.;Mencke,N.;Gerd,H.;Klaus,S.PCTInt.Appl.WO9726651(1997)(Chem.Abstr.1997,127,149148).6. Diehr,H.-J.EU.Pat.0440959(1999)(Chem.Abstr.1991,115,183323).7. Bentiss,F.;Lagrenée,M.;Wignacourt,J.P.;Holt,E.M.Polyhedron2002,21,403.8. Gao,Y.;Zhang,Z.;Xue,Q.Mat.Res.Bull.1999,34,1867.9. Seed,A.Chem.Soc.Rev.2007,36,2046.10. Higashihara,T.;Wu,H.-C.Mizobe,T.;ChienLu,C.;Ueda,M.;Chen,W.-C.Macromolecules2012,45,9046.

应变烯烃利用应变释放作为推动力，使其能够参与点击反应。反式环烷烯（通常是环辛烯）和其他应变烯烃，如氧杂降冰片二烯，可以与多种反应物发生点击反应，包括偶氮化物、四嗪和四氮唑。这些化合物可以与应变烯烃特异地相互作用，保持对脂质、脂肪酸、辅酶和其他天然产物中存在的内源烯烃的生物正交性。[1]烯烃和叠氮化物[3+2]环加成氧降冰片二烯（或另一种活性烯烃）与叠氮化物反应，生成三唑作为产物。然而，这些产物三唑不像在CuAAC或SPAAC反应中那样具有芳香性，因此不那么稳定。氧降冰片二烯的活性双键生成三唑啉中间体，随后自发地进行逆Diels-Alder反应，释放呋喃，得到1,2,3-或1,4,5-三唑。尽管这种反应很慢，但它是有用的，因为恶冰片烯的合成相对简单。然而，这种反应并不完全是化学选择性的。[2]烯烃和四嗪逆电子需求Diels-Alder反应应变环辛烯和其他活化烯烃与四嗪在逆电子需求Diels-Alder中反应，然后进行逆[4+2]环加成（见图）。[3]与反式环辛烯的其他反应一样，环应变释放是该反应的驱动力。因此，三元和四元环烯烃由于其高环应变，成为理想的烯烃底物。[3]广义四嗪和应变反式环辛烯之间的四嗪-烯烃反应与其他[4+2]环加成类似，亲二烯上的给电子取代基和二烯上的吸电子取代基加速了逆电子需求Diels-Alder。二烯，四嗪，由于具有额外的氮，对于该反应是良好的二烯。亲二烯烃，即活性烯烃，通常可以连接到目标分子上的给电子烷基上，从而使亲二烯烃更适合反应。[4]烯烃与四唑的光点击反应烯烃与四唑的“光点击”反应是Huisgen在20世纪60年代末首次引入的另一种偶极加成反应。具有氨基或苯乙烯基的四唑可以被365nm的紫外线激活（365nm不会损伤细胞），反应迅速（因此紫外线不必长时间开启，通常在1-4分钟左右），从而制备荧光吡唑啉产品。这种反应方案非常适合在活细胞中进行标记，因为365nm的紫外线对细胞的损伤最小。此外，反应进行得很快，因此紫外线可以短时间照射。短波长UV光的量子产率可以高于0.5。这允许四唑与另一个光解反应在波长上选择性地结合使用，其中在短波长下，四唑连接反应几乎完全进行，而在长波长下，另一个反应（通过邻醌二甲烷连接）完全进行。[5]最后，非荧光反应物产生荧光产物，为反应配备内置的光谱手柄。四唑和烯烃基团都作为非天然氨基酸的蛋白质手柄被引入，但这种益处并不是唯一的。相反，反应的光诱导性使其成为生命系统时空特异性的主要候选者。挑战包括内源性烯烃的存在，尽管通常是顺式的（如脂肪酸），它们仍然可以与活化的四唑反应。[6]​​​​​​​参考文献1. Lang,K.;Chin,J.(2014)."BioorthogonalReactionsforLabelingProteins".ACSChem.Biol.9(1):16-20.https://doi.org/10.1139/cjc-2013-05772. (a)vanBerkel,S.S.;Dirks,A.T.J.;Meeuwissen,S.A.;Pingen,D.L.L.;Boerman,O.C.;Laverman,P.;vanDelft,F.L.;Cornelissen,J.J.L.M.;Rutjes,F.P.J.T.ChemBioChem2008,9,1805.(b)vanBerkel,S.S.;Dirks,A.T.J.;Debets,M.F.;vanDelft,F.L.;Cornelissen,J.J.L.M.;Nolte,R.J.M.;Rutjes,F.P.J.T.ChemBioChem2007,8,1503. Liu,Fang;Paton,RobertS.;Kim,Seonah;Liang,Yong;Houk,K.N.(2013)."Diels–AlderReactivitiesofStrainedandUnstrainedCycloalkeneswithNormalandInverse-Electron-DemandDienes:ActivationBarriersandDistortion/InteractionAnalysis".J.Am.Chem.Soc.135(41):15642–15649.https://doi.org/10.1021/ja408437u4. Rieder,Ulrike;Luedtke,NathanW.(25August2014)."Alkene-tetrazineligationforimagingcellularDNA".AngewChemIntEdEngl.53(35):9168–9172.https://doi.org/10.1002/anie.2014035805. Menzel,JanP.;Feist,Florian;Tuten,Bryan;Weil,Tanja;Blinco,JamesP.;Barner‐Kowollik,Christopher(2019)."Light-ControlledOrthogonalCovalentBondFormationatTwoDifferentWavelengths".AngewandteChemieInternationalEdition.58(22):7470–7474.https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2014.05.024Ramil,CarloP;Lin,Qing(August2014)."Photoclickchemistry:afluorogeniclight-triggeredinvivoligationreaction".CurrentOpinioninChemicalBiology.21:89–95.https://doi.org/10.1038/s41570-018-0030-x